王镜岩生化第三版考研课件 DNA的生物合成.ppt

第15章 DNA的生物合成,信息流动,不含DAN的生物，RNA也可自我复制。有些病毒以自己的RNA为模板指导DNA的生物合成称为逆转录。,一、DNA的复制 二、DNA的损伤修复 三、DNA的突变提要,不要盲目相信权威，哪怕他是诺贝尔奖得主，要有自己的自由思维。--------- 教书感悟,DNA半保留复制,3、 结果与分析：,E.ColiDNA复制起始点和终止点的位置。,,,,真核生物中真核生物染色体DNA是线性双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子（multireplicon）,,,,实验结果与预测结果的双向复制吻合。因此，DNA复制多数是以双向进行的。,试验结果,预测结果,DNA不同复制方式,双向对称复制：大多数生物染色体 DNA的复制是双向的，并且是对称的。,1）DNA聚合酶（DNApolymarase）的反应，再有DNA为模板的情况下，体系中有Mg+存在，加入四种脱氧核苷三磷酸，在DNA聚合酶的催化下聚合到DNA模板分子的末端。 2）DNA聚合酶催化的产物实在模板DNA的指导下进行的。 与4种脱氧核苷三磷酸的浓度、比例激酶的性质无关，而与模板的性质有关。,加入少量小牛胸腺DNA，聚合的结果产物是小牛胸腺DNA。加入噬菌体T4的DNA，合成的产物是噬菌体T4DNA；加入人工合成的一段PolyAT为模板，产物是ATAT的共聚物。,,,5‘－－3’方向,按照模板碱基配对的原则5‘－三磷酸末端 与引物3‘端形成酯键。,DNA聚合酶 Ⅰ是一个多功能的酶分子。它可以催化以下的反应： ①通过核苷酸聚合反应，使 DNA链 5’一3’方向延长(DNA聚合酶活性）； ②由3’端水解DNA链（3’一5’核酸外切酶活性）； ③由5’端水解DNA链（5’一3’核酸外切酶活性）； ④由3’端使DNA链发生焦磷酸解；最初认为酶的外切活性是由其它酶的污染引起，经过严格纯化，仍有这一活性，经进一步研究是酶分子固有的特性。,将DNA聚合酶用蛋白酶水解，得到两个片段。 大的一段68000，由聚合作用和3－5‘外切作用； 小的片段35000只有5－3’外切作用。将两段混 合，作用如初。说明是两个酶结合起来的。,DNA聚合酶Ⅲ结构,DNA聚合酶Ⅲ为异二聚体， 它使 DNA解开的双链可以 同时进行复制，ß亚基的功 能犹如夹子、两个ß亚基夹 住DNA分子并可向前滑动， 使聚合酶在完成复制前不 再脱离DNA，,（3）DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ是在1999年才被发现的，它们涉及DNA的错误倾向修复。当 DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两个酶，使修复缺乏准确性（accuracy），因而出现高突变率。编码DNA聚合酶Ⅳ的是dinB。编码DNA聚合酶Ⅴ的基因是umuC和umuD。它能在DNA许多损伤部位继续复制，而正常DNA聚合酶在此部位因不能形成正确碱基配对而停止复制，在跨越损伤部位时就造成了错误倾向的复制。高突变率虽会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活。,DNA连接酶作用只是在双股DNA连中一条单链有缺口进行接合，不能将两条游离的DNA结合在一起。它在修复中起重要作用。 总结：1）DNAligase修复DNA双链中单链缺口；2）连接线状DNA为环状DNA（必须是粘性末端）；3）在DNA复制时与聚合酶协同作用；4）在DNA片段重组过程中进行连接。,DNA连接酶作用机理,原核生物DNA聚合酶功能比较,DNA聚合酶Ⅰ：切除引物（5’-3’外切），填补切除引物后的缺口，直至仅剩切口（5’-3’聚合）；损伤修复； DNA聚合酶Ⅱ：损伤修复（5’-3’聚合，也包括3’-5’外切）； DNA聚合酶Ⅲ：复制（5‘-3’聚合），校对（3‘-5’外切） DNA连接酶：连接DNA聚合酶Ⅰ剩下的缺口（生成磷酸酯键）,（四）DNA的半不连续复制,问题的提出：DNA的两条链都能作为模板，同时合成出两条新的互补链。根据双螺旋模型，DNA分子的两条链是反向平行的，一条链的走向为5’～3’，另一条链为3’～5’。而目前所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5’一3’ 。DNA在复制时两条链如何能够同时作为模板合成其互补链？,冈崎的发现：1968年，日本学者冈崎等用3H－脱氧胸苷标记噬菌体T4感染的E.Coli，然后通过碱性密度梯度高心法分离标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着出现较大的分子，最初出现的DNA片段长度约为 1000个核苷酸左右。用 DNA连接酶变异的温度敏感株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，便有大量DNA片段积累。,实验都说明在DNA复制过程中5’一3’方向的DNA合成实际上是首先合成较短DNA片段，然后连接起来成为大分子DNA 。这些片段称为冈崎片段（Okazaki fragment）。 。因此，冈崎等提出了DNA的不连续复制模型，认为：DNA复制以一条链合成是以5－3方向进行的，另一条链至少是不连续的。DNA模板一条是3－5‘，称为前导链，DNA合成是连续的，与复制叉方向相同；与复制叉方向相反进行的称为后随链，合成方向也是5－3’，先合成小片段然后再连接酶的作用下连成完整DNA大分子。,半不连续复制,DNA复制时，一条键是连续的，另一条链是不连续的，因此称为半不连续复制（semidiscontinuous replicaton.),对冈崎片段的分析,细菌的冈崎片段长度为1000－2000个核苷酸，相当于一个顺反子（cistron），即基因的大小；真核生物的冈崎片段长度为100－200个核苷酸，相当于一个核小体 DNA的大小。 5’末端以共价健连着一小段RNA链。用专一的核酸酶水解可以将RNA引物切去。,冈崎片段Okazaki fragment,拓扑异构酶Ⅱ,真核生物中除有Ⅰ、 Ⅱ型拓扑异构酶外，还有Ⅲ型。各自功能有所不同。,复制起始复合物,13bp序列富含AT易变性成为开链复合物（Open Complex），DnaC协助DnaB结合在解链区（Unwoundregion）,解开的单链迅速被SSB结合。此时，形成了起始复合物（Initial Complex）,DNA复制的调节发生在起始阶段，一旦开始复制，如无意外受阻，就能一直进行到完成。 复制起始物形成后，将DNA双链分开，分开之处形成复制叉结构。,,,,,DNA复制终止,真核生物有多种DNA聚合酶真核生物有多种DNA聚合酶。从哺乳动物细胞中分出5种DNA聚合酶，分别以a、β、γ、δ、ε来命名。真核生物DNA聚合酶和细菌DNA聚合酶的基本性质相同，均以4种脱氧核糖核苷三磷酸为底物，需Mg激活，聚合时必须有模板和引物 3－OH存在，链的延伸方向为 5’一3’。,端粒酶是一种含有RNA链的逆转录酶，它以所含RNA为模板来合成DNA端粒结构。通常端粒酶含有约150个碱基的RNA链，其中含二个半拷贝的端粒重复单位的模板。复制使端粒5’末端缩短，而端粒酶（telomerase）可外加重复单位到5末端上，结果维持端粒一定长度。,二、DNA的损伤修复,（一）错配修复（二）直接修复（三）切除修复（四）重组修复（五）应急反应（SOS）和易错修复,（一）错配修复,错配修复（mismatch repire）。DNA在复制过程中发生错配，如果新合成链被校正，基因编码信息可得到恢复；但是如果模板链被校正，突变就被固定。细胞错配修复系统能够区分“旧”链和“新”链。Dam甲基化酶可使旧链DNA的GATC序列中腺瞟吟N6位甲基化。复制后DNA在短期内（数分钟）为半甲基化的GATC序列，一旦发现错配碱基，即将未甲基化的链切除，并以用基化的链为模板进行修复合成。,（二）直接修复,紫外线照射可以使DNA分子中同一条链两相邻胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（TT）。这种二聚体是由两个胸腺嘧啶碱基以共价键联结成环丁烷的结构而形成的。影响了DNA的双螺旋结构，使其复制和转录功能均受到阻碍。光复活作用是一种高度专一的直接修复方式。它只作用于紫外线引起的DNA TT二聚体。光复活酶在生物界分布很广，从低等单细胞生物一直到鸟类都有，这种修复方式在植物中特别重要。而高等的哺乳类却没有。有其他修复机制所代替。,,,,解聚合,切除修复机理,有四步： 1、识别、特异性内切酶切开； 2、以另一链为模板合成 3、切去损伤链； 4、连接酶连接缺口。,在重组修复过程中， DNA链的损伤部位可能被切除，也可能未被切除。当进行第二论复制时，如果损伤还留在母链上，仍会给复制带来困难，复制经过损伤部位时所产生的缺口还需通过同样的重组过程来弥补，直至损伤被切除修复所消除。但是，随着复制的不断进行，若干代后，即使损伤始终未从亲代链中除去，而在后代细胞群中也已被稀释，实际上消除了损伤的影响。,三、DNA的突变,（一）突变的类型（二）诱变剂的作用（三）诱变剂和致癌剂的检测,,（三）诱变剂和致癌剂的检测,提要,,